叶绿素是植物叶绿体内参与光合作用中必备的基础物质之一,控制着光合速率和光合产物,从而直接影响作物的产量和品质。叶绿素计可以测量植物中叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b,叶绿素a存在于光反应中心和天线复合物中,而叶绿素b只存在于天线中。天线复合物是捕光复合物,又称捕光叶绿素2蛋白质复合物,起到吸收光能及传递光能到作用中心的作用,调控着作物对不同环境特别是光条件的适应能力,从而控制着光合作用的强度。已有研究表明,弱光条件下,叶绿素a /b的比率更低,但天线复合物所占的比例却更高。Tanaka等研究指出叶绿素b是天线复合物的调控者,因此研究叶绿素b的合成调控将更好理解植物适应不同光密度的机制。

最近,一些编码叶绿素合成的基因已被分离出来,叶绿素a氧化酶( chlorophyll a oxygenase, CAO)就是其中之一。研究表明, CAO是由叶绿素a合成叶绿素b时和必要酶。Esp ineda等通过研究缺失和渗漏拟南芥叶绿素氧化酶基因(AtCAO)发现,缺失AtCAO 基因的情况下,不能检测到或是检测到很少量的叶绿素b。AtCAO受叶绿素b的反馈调控,弱光的条件下,叶绿素a /b的比率降低,叶绿素b含量增加,反馈抑制AtCAO 基因的转录水平。众所周知,叶绿素含量与氮营养密切相关,叶绿素总量、叶绿素a与总氮量以及叶片中铵态氮含量的相关系数在0.520 – 0.557 之间,呈显著相关 ( P < 0105) ,而且从叶色分布的特点还可以诊断作物的氮素营养。本试验利用PCR技术对Tos17插入1个可能的叶绿素a氧化酶基因的插入位点进行鉴定和纯合体筛选,并分析了此基因在不同氮营养下的表达特征,为进一步利用该突变体研究此基因的功能和与氮营养的关系奠定基础。推荐使用仪器：叶绿素测量仪、SPAD-502叶绿素含量测定仪。

1　材料与方法

1.1　水稻品种

日本晴及可能有Tos17插入突变的日本腈水稻后代种子(Chb129) 。

1.2　水稻培养

Tos17插入的种子(Chb129)进行土培,在分蘖期取叶片,速冻于液氮中。野生型水稻进行水培,除氮以外其它营养液按国际水稻配方。试验设4个处理,即3个施氮处理(NH+4 Cl, KNO3和NH4NO3 )和1个继续缺氮处理,N浓度为2.5 mmol/ L,缺氮处理是先在1.25 mmol/L NH4NO3营养液中生长10 d,接着缺氮处理7 d。三叶期时取叶片样, 速冻于液氮中。　

1.3　PCR引物设计

根据KOME网站提供的侧翼序列( T09166T) ,在NCB I 网站比对, 得到与此序列完全匹配的DNA 序列为DP000086,mRNA序列为AK100517,插入位点分别在1 593 bp和1 379 bp之前。利用DNA序列设计引物,在插入位点上游112 bp 处序列设计引物chb5′,插入位点下游435 bp处序列设计引物chb3′,同时在距Tos1723′未端234 bp处设计引物tail5′(表1) 。如果用chb5′和chb3′扩增出547 bp条带( Pchb )说明没有携带Tos17插入片段,若扩不出来任何条带说明可能携带有Tos17插入片段;如果用tail5′与chb3′扩增出669 bp 条带( PT + chb ) ,说明是突变体,携带有Tos17 插入片段,否则不是突变体。

1.4　叶片DNA提取

DNA提取采用CTAB法,略有修改。取速冻于液氮中叶片011 - 012 g在液氮中研磨成粉,放到2 mL的离心管中,加入在65℃预热的DNA提取缓冲液(表2) ,剧烈摇动使充分混均,然后放入65℃水浴锅加热15 - 20 min,加等体积的氯仿2异戊醇(24∶1) ,轻摇10 - 15 min后4℃, 3 000 r/min离心15 min;转移上清液到另一个2 mL 的离心管,加等体积的异丙醇,上下颠倒混均,放入4℃冰箱反应10 min后, 4℃, 7 500 r/min离心5 min沉淀DNA,去掉上清液,加1 mL 75%的乙醇清洗DNA,离心倒掉乙醇,吹干DNA,最后加入30 - 50 μL 含RNase的TE缓冲液。

1.5　叶片RNA提取及反转录

RNA提取使用Trizol试剂( Invitrogen) ,由RNA合成cDNA 使用M2MLV 反转录酶( Promega,Madi2son,W is1,USA) ,参考文献。

1.6　PCR反应

PCR反应体系为20μL,包含10 pmol/L正反向引物各1 μL, 10 ×PCR buffer 2 μL, 215 mmol/LdNTP 116μL, Taq酶014μL,DNA模板的量为调得看家基因( actin)表达一致时的量,用灭菌水补足20μL。看家基因引物正反向序列分别为GGAACT2GGTATGGTCAAGGC 和AGTCTCATGGATAACCG2CAG,产物长度为750 bp,退火温度为53℃。

2　结果与分析

2.1　Tos17插入位点和可能功能的鉴定根据Tos17 3′端侧翼序列( T09166T) ,在NCB I上得到与此序列完全匹配基因(DP000086) ,进一步序列比较发现, Tos17插入在该基因反向互补序列的1 579 bp处是第5个外显子区域。此基因的与已发表的衣藻(AB015139)和拟南芥(AF177200)叶绿素a氧化酶蛋白质序列比较,发现与它们的同源性分别为55189%和69192% ,此基因也含有氧化酶所必有的两个保守的结合位点,即Rieske 2Fe22S蛋白结合位点(Rieske binding site)和单核心铁结合位点(mononuclear binding site) (图1) ,故判断其可能为叶绿素a氧化酶,命名为OsCAO。

2.2　PCR鉴定Tos17插入突变的水稻纯合体

分别用引物chb5′2 chb3′和tos3′2 chb3′对从日本引进的Tos17诱发的变异体后代chb1到chb9及野生型日本晴的叶片DNA进行PCR,对水稻突变体和突变体纯合子的鉴定。由图2结果表明,株系chb1和平chb8都和野生型一样仅扩出547 bp的条带,说明没有携带Tos17插入片段; chb4、chb5和chb7仅能扩出带有Tos17未端的669 bp 的条带,说明是带有Tos17插入片段的突变体,而且是纯合子;而剩下的4个株系均能扩出547 bp 和669 bp的两条带,说明它们是带有Tos17插入片段的杂合型突变株。

2.3　不同氮营养下叶绿素a氧化酶的表达特征

以持家基因actin作为内参,通过半定量PCR检测在不同形态氮营养和氮饥饿条件下OsCAO的表达特点。由图3可知,氮饥饿增强了OsCAO基因的表达,而纯铵营养抑制了它的表达。

3　讨论

鉴定到Tos17插入突变的基因,根据其蛋白质序列的分析,含有两个保守的结合位点即Rieske Fe2S蛋白结合位点和单核心铁结合位点,是一个氧化酶,类似于已鉴定的衣藻和拟南芥的叶绿素a氧化酶基因,能够催化叶绿素a合成叶绿素b ,命名此基因为OsCAO。利用PCR技术鉴定到Tos17插入在此基因的第5个外显子区域,而且从9株水稻中鉴定到3株纯合突变体,为直接利用此突变体研究其功能奠定了基础,避免了盲目性。众所周知,叶绿素与氮营养密切相关,本研究结果也表明单一铵营养抑制了OsCAO的表达,而氮胁迫增强了此基因的转录水平,这可能与影响叶绿素含量特别是叶绿素b的含量密切相关,而色素的含量变化可以作为植物预防外界胁迫的一种保护措施。李宝珍等研究不同形态氮和氮饥饿条件下总叶绿素及其叶绿素a和b的特点,结果表明单一的铵营养显著增加了总叶绿素和叶绿素b的含量,而氮饥饿条件下总叶绿素和叶绿素b的含量,这恰好与Os2CAO的表达相反。正如对拟南芥AtCAO 的研究发现,叶绿素b含量增加,反馈抑制A tCAO的转录水平。

水稻叶绿素a氧化酶与叶绿素的含量和氮营养密切相关,此基因的鉴定及其纯合体突变种的获得,对于有目的进一步的研究其功能,以及探究植物对环境胁迫的适应性有重要的作用。